Опубликована научная статья об эффективности ПЦР-зондов Фарммедполис

Р.Н. Кашапов, А.Н. Цибин

Сравнение физических характеристик и эффективности взятия биоматериала медицинскими аппликаторами

Аннотация

Пандемия коронавирусной инфекции COVID-19 вызвала резкий рост потребности в производстве расходных материалов, применяемых для лабораторной диагностики. 

Одним из которых является аппликатор (тампон), предназначенный для взятия биоматериала, а от его качества сильно зависит достоверность теста. Целью работы являлось проведение экспериментальных исследований, по оценке физических и эксплуатационных свойств медицинских аппликаторов волокнистого типа. В работе было проведено сравнение аппликаторов ведущих производителей, традиционно считающихся эталоном качества, представленных на Российском рынке в сегменте премиум класса: «Copan Diagnostics» (Италия), «Puritan Medical Products» («PMP») (США), «ФармМедПолис» («ФМП») (Россия).  Были проведены исследования величины абсорбции, Дзета-потенциала, морфологии поверхности с помощью сканирующего электронного микроскопа, а также способность взятия и высвобождения биоматериала. Исследования показали, что коэффициент извлечения отличается для различных образцовы аппликаторов.

 На примере культуры клеток Streptococcus pneumoniae установлено, что для аппликатора «Copan Diagnostics» КИ = 78,3 %, для аппликатора «Puritan Medical Products» КИ = 84,15 %, для аппликатора ФМП КИ = 87,49 %, для аппликатора «HydraFlock» ® КИ = 93,72 %. 

Установлена общая превосходная эффективность тампона «HydraFlock» ®, основанная на высокой способности абсорбировать воду и белок, а также на высокой степени извлечения бактерий. Второе место занимает аппликатор «ФармМедПолис» ®, третье – образец компании «Copan» и четвертое – нейлоновый образец «Puritan Medical Products».

Ключевые слова: COVID-19, медицинский аппликатор, извлечение биоматериала, медицинские расходные материалы.

Введение

Эффективность обнаружения вирусов, клеток и белков сильно зависит от эффективности сбора биоматериала, его сохранности при транспортировке и восстановления из питательной среды. Несмотря на то, что аспираты, жидкости организма и образцы тканей являются наиболее эффективными для первичного посева, взятие пробы с помощью аппликатора часто используется в качестве метода, применяемого при уходе за пациентами или проведении тестов [1]. Что особенно актуально стало в условиях глобальной пандемии коронавирусной инфекции COVID-19, вызванной коронавирусом SARS-CoV-2. Пандемия вызвала резкий рост потребности в производстве расходных материалов, применяемых для лабораторной диагностики. Одним из которых является аппликатор (тампон), предназначенный для взятия биоматериала, а от его качества сильно зависит достоверность теста. Так как диагностическая чувствительность клинического теста зависит от количества клеток, собранных и выпущенных аппликатором, существует постоянная потребность в правильном отборе образцов для надежной и точной диагностики.

На рынке сейчас имеются аппликаторы различных производителей широкого ценового диапазона, и столь большое разнообразие требует их сравнительной оценки. Существующие аппликаторы выполнены из различных материалов и отличаются своими физическими свойствами, которые сильно влияют на способность взятия биоматериала и его сохранность. Можно выделить два основных типа: первый – вспененного типа, имеющие открытую ячеистую структуру из полимерного материала, второй – волокнистого типа, в котором реализуется капиллярный эффект, и они хорошо впитывают, удерживают, а затем и высвобождают влагу, микробов, антигены и нуклеиновые кислоты. В свою очередь волокнистому типу можно дать разделение: первого поколения – рабочая часть аппликатора изготовлена из прядильных волокон (вискоза, дакрон, хлопок), второго поколения – на рабочую часть с помощью технологии флокирования нанесено полимерное волокно, которое находится под 900 к поверхности стержня аппликатора. Считается, что только небольшая часть организмов, собранных на традиционных тампонах из прядильного волокна, может быть восстановлена. «Rose» и др. [2] продемонстрировали, что тампон вспененного типа, извлекает на ≥ 30 % больше спор Bacillus anthracis Sterne, чем вискозный и полиэфирный тампоны, данный факт объяснялся захватом организмов между волокнами. Установлено, что первый тип, к сожалению, уступает и обладает минимальными показателями захвата биоматериала при взятии клинических образцов и проб [3]. Помимо физической структуры, на восстановление влияет химический состав материала тампона. «Dalmaso» и соавторы [4] также сообщили о значительных различиях между нейлоновым тампоном и тампоном из искусственного волокна в их способности восстанавливать различные бактерии и грибки.

Идеальный тампон должен собирать много клеток и обеспечивать их высвобождение в среду, демонстрируя при этом соответствие требованиям директивы для предполагаемого использования, как указано производителем. Поскольку волокна, используемые в головке тампона, находятся в прямом контакте с организмом, подлежащим извлечению из места отбора пробы, конструкция тампона также играет важную роль. Эффективная конструкция мазка увеличивает количество восстанавливаемых диагностических образцов. Это имеет первостепенное значение, учитывая множество различных патологических агентов, которые опосредуют болезненные состояния; существует потребность в эффективном сборе клинического образца для точного диагноза. Известны способы нанесения на рабочую часть аппликатора покрывают биополимерами, такими как альгинат или белки, для улучшения сбора и стабилизации чувствительных организмов [5-8].

Поэтому целью данной работы является проведение экспериментальных исследований, по оценке физических и эксплуатационных свойств медицинских аппликаторов волокнистого типа.

Методы исследования

В работе исследовались аппликаторы ведущих производителей, традиционно считающихся эталоном качества, представленных на Российском рынке в сегменте премиум класса.  Это три производителя: «Copan Diagnostics» (Италия), «Puritan Medical Products» («PMP») (США), «ФармМедПолис» («ФМП») (Россия). В исследовании использовались аппликаторы трех производителей с нейлоновым ворсом, а также были проведены испытания аппликатора «HydraFlock» ® компании «PMP».

Исследование абсорбции

Для измерения абсорбции использовалась методика определения поглощенной жидкости с помощью взвешивания. Производилось предварительное взвешивание аппликатора, а далее он помещался в жидкую среду на 15 с. В качестве жидкости использовали дистиллированную воду и 22 % раствор бычьей сыворотки альбумина. Помимо удерживания влаги также было произведено измерение ее поглощение самим материалом (волокном), находящимся на рабочем конце аппликатора. Для этого волокно срезалось с поверхности аппликатора, взвешивалось и помещалось в пробирку типа Эппендорф. В пробирку добавлялось 0,5 мл дистиллированной воды, проводилось взбалтывание Эппендорфа и выдержка в течении 2 мин. Далее пробирку помещали в центрифугу на 5 мин при 10000 об/мин, удаляли остатки с помощью промокашки, данная процедура проводилась три раза. После этого производилось взвешивание волокон и определялся процент поглощения белка.

Изучение микроструктуры с помощью сканирующего электронного микроскопа

Для оценки сбора материала с помощью сканирующего электронного микроскопа «Carl Zeiss EVO 50» были проведены исследования морфологии поверхности волокна после взятия проб из суспензии, состоящей из микрошариков. Микроскоп позволял проводить исследования при низком и высоком вакууме и получать изображения с увеличением от x100 до х3000. После взятия проб для оценки степени выхода материала проводился анализ до и после промывки в дистиллированной воде в течении 5 с и последующей сушки. Так как полимерные образцы имеют тенденцию накапливать электростатический заряд, что сильно мешает получению качественных изображений, проводилось напыление проводящего золото палладиевого слоя.

Измерение Дзета-потенциала. Измерение Дзета-потенциала волокон аппликатора проводились с помощью прибора «Photocor Compact-Z» («Фотокор», Россия), для этого волокна срезались с кончика аппликатора, измельчались и приготавливали суспензию из раствора KCl с изменением pH от 3 до 9. Около 200 мг. волокон аппликатора помещалось в цилиндрическую стеклянную ячейку на 3 мин и далее проводили измерение.

Исследование культуры клеток

В исследованиях культуры клеток использовался Streptococcus pneumoniae. Для исследования культуры использовали тридцать проб. Статистическая значимость разницы между средними значениями сравнивалась с помощью теста «Tukey-Kramer Honestly Signiicant Difference» [9]. Инкубацию культур проводили в течение 24 часов при 37 ° ± 1 ° C. Далее были отобраны несколько хорошо изолированных колоний и перенесены в пробирку, в которой имелся 5 мл 0,85 % стерильного физиологического раствора (pH 6,8). Мутность бактериальной суспензии доводили до 0,5 стандарта МакФарланда (1,5 × 10⁸ КОЕ/мл). Чтобы обеспечить впитывание жидкости и прилипание бактерий к головке тампона испытываемый аппликатор помещали в стеклянную пробирку на 10 с в 5 мл бактериальной суспензии (~ 10⁷ КОЕ/мл). Аппликаторы удаляли из бактериальной суспензии, выдерживали на воздухе в течение 60 с, переносили в среду для разбавления и встряхивали в течение 15 с для высвобождения бактерий. После этого проводилось разведение жизнеспособных организмов в среде для разведения (А). Количественное определение жизнеспособных организмов проводили путем распределения образцов в двух экземплярах для каждого разведения в питательной среде (B).

Бактерии культивировали при 5 % CO₂, среда для разбавления - 0,85 % физ. раствор, питательная среда - кровяной агар.

Результаты

Способность поглощения воды исследованных аппликаторов составила от 18,8 % до 21,3 %. В этой группе аппликатор «HydraFlock» ® продемонстрировал наилучшее водопоглощение, второе место с незначительным отрывом занял образец ФМП со значением 20,8 %.

Способность поглощения белка хуже по сравнению с водой и составляет от 17,4 % до 19,3 %. В данном случае аппликатор «HydraFlock» ® показал максимальный результат, а наихудший результат был у «Copan». Как видно из экспериментов именно тип волокна и его свойства являются основными при абсорбции жидкостей.

Захват и высвобождение полимерных шариков изучали и качественно оценивали с использованием модельной системы для имитации бактерий. Аппликатор «HydraFlock» ® показал хорошую способность собирать шарики, но это оказалось и минусом, так как выход шариков был меньше, чем у других образцов. При 1000-кратном увеличении у волокон аппликатора «HydraFlock» ® наблюдается расслоение структуры на 20-30 отдельных тонких волокон, длина которых составляет от 10 до 30 мкм. Остальные три образца по своей морфологии схожи друг с другом и состоят из нейлоновых волокон.

Так для волокон «HydraFlock» ®, Нейлон «PMP» и «ФМП» ® дзета-потенциал имеет только отрицательные значения, постепенно уменьшающееся с увеличением pH, а для Нейлон «Copan» с увеличением pH наблюдается переход от положительного значения (при pH от 3 до 6) к отрицательному (при pH от 6 до 9).

Правильный сбор, хранение и транспортировка биоматериалов не должны недооцениваться и являются важными составляющими качественной системы здравоохранения. Поэтому оценка эксплуатационных свойств аппликаторов необходима для понимания возможных рисков получения хорошего клинического образца, требующегося для эффективной диагностики при лабораторном анализе. Несмотря на то, что самым эффективным является использование непосредственно экссудатов и аспиратов жидкостей, но из-за высокого удобства и практичности использования взятия мазков с помощью аппликаторов получило широкое распространение. Оценка эксплуатационных свойств аппликаторов включает в себя исследование абсорбции, собирательной способности, сохранения влаги, Дзета-потенциала. Все эти параметры непосредственно влияют на сбор и высвобождение бактерий, возможность поддерживать жизнеспособность при транспортировке до лаборатории. Поглощение воды включает в себя две составляющие: несвязанную воду, которая покрывает волокна, и связанную, которая впитывается в материал или каким-либо другим способом удерживается на поверхности. Данный параметр определяется химическим составом, микроструктурой и полярностью поверхности.

Известным фактом является наличие плохих гидрофильных свойств у синтетических волокон, поэтому ведущие производители аппликаторов разрабатывают и внедряют специальные технологии повышения данного показателя. Водопоглощающая способность аппликатора имеет важную роль при извлечении бактерий и других микроорганизмов, она может достигаться путем капиллярных эффектов, а водоудержание необходимо для предотвращения эффекта обезвоживания. Исследования показали явную зависимость дзета-потенциала образцов от pH-среды и совершенно разные значения для различных производителей. Это может быть связано с различием в химическом составе волокон, а также обработки их поверхности. Знак дзета-потенциала описывает природу электростатического потенциала вблизи поверхности частицы, если он достаточно большой, то короткодействующих притягивающих сил Ван-дер-Ваальса будет недостаточно. Более высокое значение дзета-потенциала волокон аппликатора будет приводить к отталкиванию, а это в свою очередь может привести к меньшему захвату бактерий.

Анализ СЭМ-изображений выявил морфологические и структурные различия между разными аппликаторами. Следует отметить особенность для аппликатора «HydraFlock» ®, волокно на своих кончиках имеет расслоение и тем самым обеспечивает эффективный сбор микроорганизмов. Остальные образцы волокон Нейлон «PMP», Нейлон «Copan» и «ФМП» ® имели схожую морфологию.

Экспериментальные исследования показали, что коэффициент извлечения (КИ) отличается для различных образцовы аппликаторов. На примере культуры клеток Streptococcus pneumoniae установлено, что для аппликатора «Copan Diagnostics» КИ = 78,3 %, для аппликатора «Puritan Medical Products» КИ = 84,15 %, для аппликатора «ФМП» КИ = 87,49 %, для аппликатора «HydraFlock» ® КИ = 93,72 %. Ключевым выводом данной работы является определение рейтинга аппликаторов. Установлена общая превосходная эффективность тампона «HydraFlock» ®, основанная на высокой способности абсорбировать воду и белок, а также на высокой степени извлечения бактерий. Второе место занимает аппликатор «ФармМедПолис» ®, третье – образец компании «Copan» и четвертое – нейлоновый образец «Puritan Medical Products».

Литература

1. Harry K., Madhusudhan K. Effect of protein coating of locked swabs on the collection and release of clinically important bacteria // Indian Journal of Medical Microbiology. 2014. Vol. 32. № 3. PP. 301-303.

2. Rose L., Jensen B., Peterson A., Banerjee S.N., Arduino M.J. Swab materials and Bacillus anthracis spore recovery from nonporous surfaces // Emerging Infectious Diseases. 2004. Vol. 10. № 6. PP. 1023-1029.

3. Verhoeven P., Grattard F., Carricajo A., Pozzetto B., Berthelot P. Better detection of Staphylococcus aureus nasal carriage by use of nylon locked swabs // Journal of Clinical Microbiology. 2010. № 48. PP. 4242‑4244.

4. Dalmaso G., Bini M., Paroni R., Ferrari M. Qualification of highrecovery, flocked swabs as compared to traditional rayon swabs for microbiological environmental monitoring of surfaces // PDA journal of pharmaceutical science and technology. 2008. № 62. PP. 191-199.

5. Ross P.W. The isolation of Streptococcus pyogenes from throat swabs // Journal of Medical Microbiology. 1977. № 10. PP. 69‑76.

6. Norrod P., Williams R.P. Stability and viability of Neisseria gonorrhoeae in various solutions and buffers // Applied and Environmental Microbiology. 1979. № 37. PP. 293‑297.

7. Hirchman J.S., Perry J.L. Modification of swab applicators providing full compliance with NCCLS standard M40‑A / 104th ASM General Meeting in New Orleans. LA. 104th ASM General Meeting. Washington. ASM Press. 2004. PP. 164.

8. Jerris R.C., Jarrett D.K., Cherney W. Comparison of StartSwb II with BD culture MaxV (+) transport systems for preservation of bacterial pathogens important in pediatric medicine: Hemophilus inluenzae, Streptococcus pneumoniae, and Neisseria meningitides / ASM 105th General Meeting in Atlanta, GA. ASM 105th General Meeting. Washington. ASM Press. 2005. PP. 300.

9. Sall J., Creighton L., Lehman A. JMP Statistics: A guide to statistics and data analysis using JMP. NC. USA. SAS Publishing. 2007. PP. 5‑600.